توکسوپلاسما گوندای انگل تک¬یاخته داخل سلولی اجباری است که در تمام دنیا از نظر پزشکی و دامپزشکی اهمیت قابل توجهی دارد. تشخیص دقیق توکسوپلاسموز به عنوان یک بیماری مشترک در حیوانات تولید کننده غذا همچون گاومیش¬های رودخانه¬ای از نظر بهداشت عمومی از اهمیت به سزایی برخوردار است. جستجوی آنتی¬ژن¬ها یا آنتی¬بادی¬های اختصاصی ضد توکسوپلاسما گوندای در تشخیص بیماری ناشی از آن مهم است. پروتئین¬های نوترکیب موجب افزایش حساسیت و ویژگی و همچنین کاهش مشکلات استاندارد سازی و تکرارپذیری کیت¬های تشخیصی می¬گردد. هدف از انجام این مطالعه طراحی آزمایش الایزا با استفاده از ترکیبی از آنتی¬ژن¬های نوترکیب پروتئین گرانول متراکم 7 (TgGRA7) و پروتئین سوبتیلیزین مانند 1 (TgSUB1) توکسوپلاسما گوندای جهت تشخیص سرمی توکسوپلاسموز در گاومیش¬های رودخانه¬ای بود. برای این منظور در ابتدا با استفاده از نرم¬افزارهای بیوانفورماتیک مناطق دارای آنتی¬ژنسیته بالا در این دو پروتئین آنالیز و انتخاب شد. سپس قطعات DNA انتخاب شده مربوط به این پروتئین¬ها تکثیر و در ناقل بیانی pET28aکلون گردید. پروتئین¬های نوترکیب همجوش شده با برچسب پلی¬هیستیدینی (6xHis-tag) در باکتری E. Coliسویه BL21 (DE3) بیان و سپس با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی با رزین Ni-NTA تحت شرایط دناچوره تخلیص گردیدند. پروتئین¬های GRA7 (وزن ملکولی 27 کیلودالتن) و SUB1 (وزن ملکولی 31 کیلودالتن) نوترکیب با روش¬های SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتی¬بادی ضد HisG-HRPتایید شدند. سپس آنتی¬ژن¬های TgGRA7و TgSUB1 و ترکیب آن¬ها به عنوان یک مارکر بالقوه تشخیصی برای عفونت توکسوپلاسموز توسط سه الایزای غیرمستقیم شامل الایزای GRA7، الایزای SUB1 و الایزای ترکیبی به شکل جداگانه با استفاده از 223 نمونه سرمی گاومیش رودخانه¬ای مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج این سه الایزا از نظر آماری تجزیه و تحلیل و با نتایج کیت الایزای غیرمستقیم تجاری (ID.vet، فرانسه) مقایسه گردید. آنالیز آماری نتایج نشان¬دهنده این است که هیچ اختلاف معنی داری از نظر تفکیک سرم¬های مثبت و منفی بین این آزمایش¬ها وجود ندارد (05/0< p). همچنین توافق تقریباً کامل بین هر سه الایزا و کیت تجاری مشاهده شد (آماره کاپا = 812/0، 919/0 و 874/0؛ 001/0>p ). در آنالیز آماری تعیین سطح زیر منحنی (ROC) نقاط برش الایزای GRA7، الایزای SUB1 و الایزای ترکیبی ( به ترتیب 357/0، 2445/0 و 4115/0) به گونه¬ای تعیین شد که بالاترین حساسیت و ویژگی نسبی را در مقایسه با نتایج کیت تجاری داشته باشند. در این نقاط برش هر سه الایزا حساسیت نسبی 98 درصدی را در مقایسه با کیت الایزای تجاری نشان دادند. ویژگی نسبی سه آزمایش الایزا به ترتیب 3/88، 3/95 و 4/92 درصد بود. یافته¬های حاصل از این مطالعه نشان می¬دهند که TgGRA7 و TgSUB1 مارکرهای تشخیصی امیدوارکننده¬ای برای تشخیص عفونت با توکسوپلاسما گوندای در گاومیش¬های رودخانه¬ای هستند. با این وجود به نظر می¬رسد TgSUB1 به منظور استفاده به عنوان آنتی¬ژن در آزمایش الایزا مناسب¬تر باشد. الایزاهای طراحی شده از حساسیت و ویژگی بالایی برخوردار هستند، اما بایستی روی تعداد زیادتری نمونه سرمی آزمایش شوند تا قابل اعتماد بودن و تکرارپذیری آن¬ها جهت تشخیص سرمی توکسوپلاسموز در گاومیش¬های رودخانه¬ای ارزیابی شود.
 

پیروپلاسموز اسب‌ها، به بیماری حاصل از دو تک¬یاخته خونی، تیلریا اکوئی و بابزیا کابالی، اطلاق می‌شود که با گزش کنه‌های آلوده منتقل گردیده و موجب تب، کم¬خونی و زردی مخاطات در اسب¬ها می‌گردد. این بیماری به‌عنوان یکی از عوامل چالش‌برانگیز نقل‌وانتقال بین¬المللی اسب¬ها شناخته می¬شود و تحت نظارت سازمان جهانی بهداشت حیوانات قرار دارد. زیان اقتصادی ناشی از آن هنگفت است و شامل هزینه‌های درمان به‌ویژه در مورد اسب‌های به‌شدت آلوده، سقط، کاهش بازده، مرگ و محدودیت در صادرات و شرکت جُستن اسب‌های آلوده در رویدادهای ورزشی مرتبط با اسب‌ها می‌شود. یکی از جنبه‌های قابل‌تامل این بیماری سازوکار وقوع کم‌خونی است. شناخت بهتر این سازوکار می‌تواند کمک شایانی در انتخاب شیوه‌های مناسب‌تر درمانی و پیشگیرانه بنماید. در این پژوهش شاخص¬های مرتبط با وضعیت اکسیدانی و آنتی‌اکسیدانی به‌منظور ارزیابی نقش احتمالی استرس اکسیداتیو در ایجاد کم‌خونی در پیروپلاسموز ناشی از تیلریا اکوئی در اسب مورد بررسی قرار گرفت. جامعه اسب‌های موردبررسی در این مطالعه، اسب¬های نژاد اصیل عرب منطقه اهواز و دارای شناسنامه از فدراسیون سوارکاری ایران بودند. نمونه‌های خون موردنیاز در این مطالعه به دو روش تهیه گردید: 1- نمونه‌گیری از اسب‌های دارای نشانه‌های درمانگاهی مرتبط با پیروپلاسموز (14 راس) و 2- نمونه‌گیری از اسب‌های به‌ظاهر سالم از چهار اسب‌داری اهواز (45 راس). در آزمایشگاه کلینیکال پاتولوژی (دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز) ارزیابی‌های خون‌شناسی و انگل‌شناسی بر روی نمونه‌ها انجام گرفت. همچنین از آزمون PCR برای بررسی آلودگی نمونه‌ها به تیلریا اکوئی و بابزیا کابالی استفاده گردید. در صورت یافتن توالی مربوط به بابزیا کابالی در آزمون PCR و یا مشاهده آن یا سایر انگل‌ها در زمان بررسی گستره¬های خونی، نمونه مذکور از روند مطالعه خارج می‌گردید. اسب‌ها بر اساس نشانه‌های درمانگاهی و نتایج آزمون PCR به سه گروه شاهد، آلوده و بیمار تقسیم‌بندی شدند. ارزیابی استرس اکسیداتیو با سنجش کربونیل پروتئین‌ها، مالون¬دی¬آلدهید، گلوتاتیون، فعالیت تام آنتی‌اکسیدانی، کاتالاز و غلظت فلزات آهن، مس و روی صورت پذیرفت. بررسی آماری نتایج خون¬شناسی و بیوشیمیایی در گروه¬های تعریف‌شده با استفاده از نسخه شانزدهم نرم‌افزار SPSS و آزمون¬های آنالیز واریانس یک¬طرفه یا کروسکال - والیس صورت پذیرفت. مقایسه آماری بین روش‌های تشخیصی، بررسی میکروسکوپی و PCR، در شناسایی موارد آلودگی با استفاده از آزمون مک¬نمار انجام گرفت و میزان توافق بین دو روش با محاسبه آماره کاپا بررسی گردید. در نمونه¬های اخذشده در این پژوهش تنها تیلریا اکوئی شناسایی شد. همچنین برای نخستین بار وقوع آلودگی به تیلریا اکوئی در منطقه اهواز به روش PCR مورد تایید قرار گرفت. در بررسی گستره¬های خونی رنگ¬آمیزی شده، تیلریا اکوئی در 28 مورد مشاهده گردید، درحالی‌که با بهره‌گیری از آزمون PCR، 35 اسب، آلوده به تک‌یاخته مذکور تشخیص داده شد که این اختلاف ازنظر آماری معنی‌دار بود (05/0>P). نتایج خون¬شناسی نشان داد که پیروپلاسموز اسب‌ها موجب کم¬خونی، افزایش شمار گویچه¬های سفید، نوتروفیل¬ها، منوسیت¬ها و نسبت نوتروفیل به لنفوسیت و کاهش شمار پلاکت¬ها در اسب¬های بیمار می‌گردد، درحالی‌که در گروه آلوده به‌جز یک کم¬خونی خفیف، تفاوت آشکاری با گروه شاهد مشاهده نمی¬شود. همچنین تفاوت‌های معنی‌داری بین اسب‌های آلوده و بیمار در شاخص¬های کربونیل پروتئین¬ها، مالون¬دی¬آلدهید، فعالیت تام آنتی‌اکسیدانی، کاتالاز، گلوتاتیون گویچه¬های سرخ و عناصر مس و روی با گروه شاهد مشاهده شد (05/0>P). نتایج این پژوهش نشان داد که در پیروپلاسموز اسب¬ها علاوه بر دگرگونی در سیمای خون‌شناسی، در شاخص‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو نیز تغییراتی پدید می¬آید که می‌تواند نمایانگر آسیب اکسیداتیو به گویچه‌های سرخ باشد. از این رو بایسته است با در نظر داشتن نقش استرس و آسیب اکسیداتیو در ایجاد کم¬خونی، راهکارهای درمانی درخوری برای بهبود شرایط و یا رفع آلودگی در اسب¬های آلوده به پیروپلاسموز در نظر گرفته شود.